-
- 1800 2010
- VN
Đào tạo
Array
(
[0] => stdClass Object
(
[id] => 68
[id_crawler] =>
[category_product] => NULL
[thumbnail] => dao-tao/2019.8.14_trung_tam_xn_hcm_(7).jpg
[album] =>
[url_video] =>
[is_status] => 1
[is_featured] => 0
[is_form] => 0
[displayed_time] => 2018-09-20
[program] => 0
[number] => 1
[viewed] => 0
[type] =>
[type_career] =>
[level] =>
[address] =>
[address_career] =>
[expiration_time] => 0000-00-00
[created_time] => 2019-09-06 14:17:20
[updated_time] => 2019-09-11 11:38:56
[files] =>
[salary] =>
[time] =>
[created_by] =>
[is_table_content] =>
[language_code] => vi
[slug] => giai-trinh-tu-bang-phuong-phap-sanger-su-dung-he-thong-dien-di-mao-quan
[title] => Giải trình tự bằng phương pháp Sanger sử dụng hệ thống điện di mao quản
[description] => Trong những năm gần đây Hãng illumina – Mỹ đã cho ra đời các hệ thống máy giải trình tự DNA thế hệ mới (NGS) với các tính năng, ưu điểm vượt trội so với các thế hệ trước đây.
[content] => Tổng quan xét nghiệm
Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá sinh học người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977. Phương pháp này dựa trên nguyên lý kết thúc chuỗi và sự phân tách DNA theo kích thước trên gel. GENTIS ứng dụng kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye temination sequencing) và hệ thống điện di mao quản đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng, chính xác và hiệu quả hơn. Kỹ thuật này thường được sử dụng để giải trình tự các đoạn ADN ngắn dưới 900 base.
.jpg)
Hình: Hệ thống điện di mao quản ABI3130xl và hình ảnh peak kết quả
Các dịch vụ giải trình tự của Gentis
- Giải trình tự định danh vi khuẩn
- Giải trình tự định danh nấm
- Giải trình tự xác định đột biến kháng thuốc trên gene rpoB và pncA của vi khuẩn lao
Các loại mẫu sử dụng
- Mẫu DNA đã được tách chiết
- Sản phẩm của phản ứng sequencing
Giải trình tự trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới (NGS)
Tổng quanTrong những năm gần đây Hãng illumina – Mỹ đã cho ra đời các hệ thống máy giải trình tự DNA thế hệ mới (NGS) với các tính năng, ưu điểm vượt trội so với các thế hệ trước đây.
Ngày nay với sự phát triển nhanh của khoa học công nghệ và yêu cầu về dữ liệu thu được trong lĩnh vực nghiên cứu di truyền mà các kỹ thuật giải trình tự truyền thống không đáp ứng được. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing- NGS) đã được phát triển để giải quyết các vấn đề trên.
Ưu điểm của công nghệ giải trình tự thế hệ mới:
- Thời gian đọc nhanh
- Dữ liệu đầu ra lớn
- Tiết kiệm chi phí
Ứng dụng của các hệ thống NGS tại GENTIS
- Ứng dụng trong Khoa học hình sự: Truy nguyên cá thể người, xác định quan hệ huyết thống và xác định hài cốt.
- Ứng dụng trong ngành y tế: Xét nghiệm phôi tiền làm tổ (PGTest), sàng lọc trước sinh không xâm lấn (NIPT), xét nghiệm chẩn đoán ung thư, xét nghiệm căn nguyên các bệnh truyền nhiễm, xét nghiệm kiểu gen các chủng vi khuẩn...
- Phân tích, nghiên cứu metagenomics.
- Phân tích kiểu gen HLA độ phân giải cao.
- Giải trình tự toàn bộ hệ gene (Whole Genomes Sequencing)
- Giải trình tự hệ gene biểu hiện (Whole Exon Sequencing)
Tại sao nên lựa chọn GENTIS
- GENTIS sở hữu các hệ thống NGS của Illumina là Miseq, MiseqFGX và NextSeq 550.
- Đội ngũ chuyên gia và kỹ thuật viên của GENTIS là những chuyên gia giàu kinh nghiệm, hoạt động lâu năm về NGS.
- Tối ưu quy trình để giảm giá thành dịch vụ.
- Thời gian trả kết quả nhanh.
1. Nguyên lý cơ bản
Về cơ bản, nguyên lý của giải trình tự thế hệ mới bằng phướng pháp tổng hợp tương tư như giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger, trong đó DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA hình thành bằng cách sử dụng dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi DNA đang tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên, đối với giải trình tự thế hệ mới, thay vì giải trình tự một đoạn đơn lẻ, kỹ thuật này cho phép giải trình tự với một lượng lớn các đoạn DNA khác nhau song song tại cùng một thời điểm, từ đó tiết kiểm thời gian và cho lượng dữ liệu đầu ra vô cùng lớn so với phương pháp Sanger cũ.
2. Quy trình chung
-Tạo thư viện: DNA cần giải trình tự được tách chiết và cắt thành các mảnh nhỏ (nếu cần) và gắn các adapter cần thiết cho quá trình giải trình tự
- Tạo cluster: mỗi sợi DNA được giữ lại trên bề mặt thiết bị giải trình tự (flowcell) bằng adapter đã được gắn trước đó. Mỗi sợi DNA sau khi được khuếch đại sẽ tạo thành một cụm DNA (cluster) có trình tự giống hệt nhau để sử dụng cho quá trình giải trình tự.
- Giải trình tự: dNTP có gắn các tín hiệu huỳnh quang tương ứng với 4 loại nucleotide, Tín hiệu huỳnh quang của từng nulceotide được ghi lại trong quá trình tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung trên sợi DNA khuôn.
- Phân tích kết quả: Kết quả từ quá trình giải trình tự được phân tích tùy theo mục đích sử dụng.
Quá trình sợi DNA được gắn vào bề mặt flowcel bằng adapter đặc hiệu (hình bên trái), cluster được hình thành (ở giữa) và quá trình giải trình tự (bên phải)
3. Đào tạo về kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới sử dụng phương pháp tổng hợp
- Nguyên lý của kỹ thuật:
+ Nguyên lý của quá trình tạo thư viện
+ Nguyên lý của quá trình tạo cluster và giải trình tự
+ Nguyên lý của quá trình phân tích kết quả (các loại dữ liệu tin sinh, các thuật toán sử dụng)
+ Kiểm soát chất lượng và các thông số kiểm soát chất lượng của quá trình giải trình tự thế hệ mới bằng phướng pháp tổng hợp.
- Quy trình thực hiện
- Ứng dụng của kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong xét nghiệm và phân tích di truyền
[content_more] => [meta_title] => Giải trình tự thế hệ mới bằng phương pháp tổng hợp (ILLUMINA) [meta_description] => Giải trình tự thế hệ mới bằng phương pháp tổng hợp (ILLUMINA) [meta_keyword] => Giải trình tự thế hệ mới bằng phương pháp tổng hợp (ILLUMINA) [thumbnail_alt] => [post_id] => 46 [category_id] => 17 ) [2] => stdClass Object ( [id] => 44 [id_crawler] => [category_product] => NULL [thumbnail] => dao-tao/pcr.jpg [album] => [url_video] => [is_status] => 1 [is_featured] => 0 [is_form] => 0 [displayed_time] => 2018-07-11 [program] => 0 [number] => 1 [viewed] => 0 [type] => [type_career] => [level] => [address] => [address_career] => [expiration_time] => 0000-00-00 [created_time] => 2019-09-05 11:28:20 [updated_time] => 2019-09-11 11:41:46 [files] => [salary] => [time] => [created_by] => [is_table_content] => [language_code] => vi [slug] => ky-thuat-pcr [title] => Kỹ thuật PCR [description] => PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau. [content] =>Nguyên lý
PCR là quá trình tổng hợp sợi DNA mới dựa trên DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác của enzyme DNA polymerase.
Thành phần phản ứng PCR
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.
- Cặp mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn (dưới 50bp) để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.
- Nucleotides (dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase tổng hợp DNA mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm các bước:
Bước 1: Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 96 °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng.
Bước 2: Biến tính (Melting): DNA khuôn ở dạng sợi đôi được tách thành 2 sợi đơn.
Bước 3: Gắn mồi (Annealing): Mồi được gắn vào DNA khuôn ở vị trí có trình tự bổ sung, bắt đầu quá trình tổng hợp.
Bước 4: Kéo dài (Elongation): Các nucleotide được gắn vào chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.
Bước 5: Lặp lại bước 2-4 (số lần lặp lại là số chu trình nhiệt, tùy thuộc vào từng loại phản ứng PCR).
Ứng dụng
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Các vấn đề của PCR
- Thiết kế mồi cho phản ứng PCR: Đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu của mồi, nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược, khả năng tạo primer dimer…
- Các loại PCR: Tùy vào mục đích sử dụng, đặc điểm của DNA khuôn và kích thước đoạn đích mà có thể sử dụng các loại PCR: PCR thường, RT-PCR, Long range- PCr, touch down PCR…
- Tối ưu hóa phản ứng PCR: Thay đổi các điều kiện phản ứng như nhiệt độ gắn mồi, nồng độ các thành phần phản ứng, chu kỳ nhiệt… nhằm khuếch đại tốt nhất đoạn đích cần khuếch đại với độ đặc hiệu cao.
[content_more] => [meta_title] => Kỹ thuật PCR [meta_description] => PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau. [meta_keyword] => Kỹ thuật PCR [thumbnail_alt] => [post_id] => 44 [category_id] => 17 ) [3] => stdClass Object ( [id] => 40 [id_crawler] => [category_product] => NULL [thumbnail] => dao-tao/pcr-001.jpg [album] => [url_video] => [is_status] => 1 [is_featured] => 0 [is_form] => 0 [displayed_time] => 2018-07-09 [program] => 0 [number] => 1 [viewed] => 0 [type] => [type_career] => [level] => [address] => [address_career] => [expiration_time] => 0000-00-00 [created_time] => 2019-09-05 10:38:19 [updated_time] => 2019-09-11 11:42:01 [files] => [salary] => [time] => [created_by] => [is_table_content] => [language_code] => vi [slug] => ky-thuat-realtime-pcr [title] => Kỹ thuật Realtime PCR [description] => Bên cạnh việc phân tích sự khuếch đại DNA đích trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, kỹ thuật Realtime PCR còn được sử dụng để phân tích nhiệt độ chảy, thể hiện qua biểu đồ ghi lại tín hiệu của mẫu phụ thuộc vào nhiệt độ. [content] =>1. Nguyên lý
Kỹ thuật Realtime là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra. Các tín hiệu này được phát hiện và ghi lại dưới dạng biểu đồ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về số lượng sản phẩm khuếch đại DNA đích có mặt ở mỗi chu kỳ.
Bên cạnh việc phân tích sự khuếch đại DNA đích trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, kỹ thuật Realtime PCR còn được sử dụng để phân tích nhiệt độ chảy, thể hiện qua biểu đồ ghi lại tín hiệu của mẫu phụ thuộc vào nhiệt độ.
2. Đào tạo về kỹ thuật realtime PCR
- Nguyên lý cơ bản của xét nghiệm Realtime PCR:
+ Realtime PCR sử dụng huỳnh quang chèn
+ Realtime PCR sử dụng Probe Taqmen
+ Realtime PCR sử dụng Probe Beacon
+ Realtime PCR sử dụng Probe Hybridization
- Thiết kế mồi và probe trong phản ứng realtime PCR
- Ứng dụng của Realtime PCR trong xét nghiệm:
+ Xác định sự có mặt của DNA đích trong mẫu (định tính)
+ Định lượng lượng DNA đích trong mẫu (định lượng tương đối, đinh lượng tuyệt đối)
+ Định type vi sinh vật
- Quy trình thực hiện một xét nghiệm sử dụng kỹ thuật Realtime PCR
[content_more] => [meta_title] => Kỹ thuật Realtime PCR [meta_description] => Bên cạnh việc phân tích sự khuếch đại DNA đích trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, kỹ thuật Realtime PCR còn được sử dụng để phân tích nhiệt độ chảy, thể hiện qua biểu đồ ghi lại tín hiệu của mẫu phụ thuộc vào nhiệt độ. [meta_keyword] => Kỹ thuật Realtime PCR [thumbnail_alt] => [post_id] => 40 [category_id] => 17 ) [4] => stdClass Object ( [id] => 39 [id_crawler] => [category_product] => NULL [thumbnail] => dao-tao/giai-trinh-tu-sanger3.png [album] => [url_video] => [is_status] => 1 [is_featured] => 0 [is_form] => 0 [displayed_time] => 2018-07-17 [program] => 0 [number] => 1 [viewed] => 0 [type] => [type_career] => [level] => [address] => [address_career] => [expiration_time] => 0000-00-00 [created_time] => 2019-09-05 10:11:13 [updated_time] => 2019-09-11 11:42:08 [files] => [salary] => [time] => [created_by] => [is_table_content] => [language_code] => vi [slug] => giai-trinh-tu-bang-phuong-phap-sanger [title] => Giải trình tự bằng phương pháp Sanger [description] => Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá sinh học người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977. [content] =>Nguyên lý của giải trình tự bằng Sanger
Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi.
Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene.
Các bước thực hiện
Giải trình tự DNA theo Sanger thực hiện các bước giống kỹ thuật PCR, trong đó thành phần của phản ứng bao gồm những chất cần thiết để nhân bản DNA:
- Một enzyme DNA polymerase: xúc tác phản ứng kéo dài mạch;
- Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởi đầu cho polymerase;
- Trình tự DNA
- 4 loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
- 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị phóng xạ.
Trong thí nghiệm của Sanger, sử dụng 4 ống nghiệm chứa 4 loại ddNTP khác nhau được đánh dấu đồng vị phóng xạ đồng thời được thực hiện phản ứng tổng hợp. Sau đó sản phẩm của 4 ống nghiệm được điện di hiện hình đồng vị phóng xạ trên cùng một bản gel để quan sát các band DNA.
Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel mà xác định trình tự các nucleotide theo chiều từ 5 -3 từ dưới lên trên.
Ngày nay người ta sử dụng các máy giải trình tự động để sắp xếp trình tự các band điện di. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye temination sequencing) sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn. Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng .
Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động. Cấu tạo của máy gồm 16 mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lần điện di. Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng (peak) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Ưu nhược điểm của giải trình tự Sanger
Giải trình tự Sanger có thể thực hiện với các đoạn DNA tương đối dài (khoảng 900 cặp base). Tuy nhiên, giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger là tốn kém và không hiệu quả cho các dự án có quy mô lớn hơn, như trình tự toàn bộ hệ gen hay metagenome.
[content_more] => [meta_title] => Giải trình tự bằng phương pháp Sanger [meta_description] => Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá sinh học người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977. [meta_keyword] => Giải trình tự bằng phương pháp Sanger,sanger,giải trình tự [thumbnail_alt] => [post_id] => 39 [category_id] => 17 ) [5] => stdClass Object ( [id] => 33 [id_crawler] => [category_product] => NULL [thumbnail] => dao-tao/miseq_(2).jpg [album] => [url_video] => [is_status] => 1 [is_featured] => 0 [is_form] => 0 [displayed_time] => 2018-07-03 [program] => 0 [number] => 1 [viewed] => 0 [type] => [type_career] => [level] => [address] => [address_career] => [expiration_time] => 0000-00-00 [created_time] => 2019-09-04 10:02:10 [updated_time] => 2019-09-11 11:42:45 [files] => [salary] => [time] => [created_by] => [is_table_content] => [language_code] => vi [slug] => dieu-tuyet-voi-ma-miseq-fgx-may-giai-trinh-tu-gen-the-he-moi-mang-toi [title] => Điều tuyệt vời mà MISEQ FGX- máy giải trình tự gen thế hệ mới mang tới [description] => Máy giải trình tự gen có một ý nghĩa đặc biệt trong phân tích và xét nghiệm gen di truyền. Hiện nay, hãng Illumina của Hoa Kỳ vừa cho ra máy giải trình tự gen thế hệ mới - Miseq FGX với nhiều tính năng vô cùng ưu biệt. [content] =>.jpg)
Cụ thể:
Ứng dụng của Miseq FGX trong Khoa học Hình sự
- Truy nguyên cá thể người
- Xác định quan hệ huyết thống
- Xác định hài cốt
Ứng dụng trong ngành y tế
Xét nghiệm chẩn đoán ung thư
Xét nghiệm căn nguyên các bệnh truyền nhiễm
Xét nghiệm kiểu gen các chủng vi khuẩn…
- Phân tích, nghiên cứu metagenomics.
- Nghiên cứu, phân tích mức độ biểu hiện gen.
- Phân tích kiểu gen HLA độ phân giải cao.
- Giải trình tự gen (Genomes Sequencing).
Quy trình phân tích:
Bước 2: Định lượng ADN
Bước 3: Chuẩn bị thư viện mẫu
Bước 4: Giải trình tự trên máy Miseq
Bước 5: Phân tích kết quả.
.jpg)
Các kỹ thuật viên GENTIS Tp.HCM đang vận hành máy Miseq
Kết quả ứng dụng triển khai thiết bị Miseq phiên bản cho khoa học hình sự (Miseq FGX) giữa Viện khoa học hình sự, Công ty Biomedic và Gentis bằng việc phân tích 14 mẫu là các dấu vết, mẫu vật trong các vụ việc bao gồm: mẫu máu, tóc, tế bào miệng, mô, xương và 96 mẫu máu cho thấy:
- Miseq FGX đã đưa ra đầy đủ kiểu gen của các locus gen có trong các bộ Kit sử dụng cho giám định ADN và xác định huyết thống đã sử dụng trước đây (16 locus STR).
- Với số lượng lớn 233 Marker chỉ thị cho phép truy nguyên cá thể và xác định quan hệ huyết thống với độ chính xác rất cao.
- Các mẫu có chất lượng kém (biến tính) vẫn thu được kết quả ở các locus gen có kích thước ngắn.
- Phát hiện đột biến ở các STR.
- MiseqFGx phân tích được nhiều Marker khác nhau, do đó dễ dàng giải quyết được những trường hợp phức tạp mà không cần phải cân nhắc lựa chọn bộ Kit nào.
- Có độ phân giải cao, ngoài việc đếm các đoạn lặp, hệ thống MiseqFGx còn giải trình tự các đoạn lặp và chỉ ra các đoạn lặp khác nhau nhưng có cùng kích thước.
- Giải trình tự các SNP tăng độ chính xác và tăng lượng thông tin thu nhận được từ các mẫu ADN bị đứt gẫy.
- Phân biệt các mẫu lẫn bằng tín hiệu màu và chất lượng đồ thị.
- Định hướng kiểu hình (màu da, màu mắt) và chủng tộc thông qua phân tích các SNP.
-645x421.jpg)
Giải trình tự bằng phương pháp Sanger sử dụng hệ thống điện di mao quản
Giải trình tự thế hệ mới bằng phương pháp tổng hợp (ILLUMINA)
Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật Realtime PCR
Giải trình tự bằng phương pháp Sanger
-360x194.jpg)
Điều tuyệt vời mà MISEQ FGX- máy giải trình tự gen thế hệ mới mang tới
Quý khách vui lòng điền thông tin bên dưới để được hỗ trợ,
tư vấn một cách tốt nhất!
Xem Socolive trực tuyến tiếng Việt
Link Bóng Đá Lu miễn phí
Link Rakhoi TV bóng đá trực tuyến
Xem tructiep https://xoilaczll.tv/
Link trực tiếp MitomTV bình luận tiếng Việt https://f8betht.baby Xem tructiep https://uniscore.com/vi NEW88 NEW88 789BET 789BET 789BETQuý khách vui lòng điền thông tin bên dưới để được hỗ trợ,
tư vấn một cách tốt nhất!
