Hoàn thiện kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong phân tích lệch bội nhiễm sắc thể tinh trùng

TÓM TẮT

Tinh trùng bị lệch bội nhiễm sắc thể (NST) có thể trực tiếp gây ảnh hưởng xấu tới kết quả thai kỳ. Hiện nay, phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp phổ biến nhất và có nhiều ưu thế trong việc xác định sự lệch bội các NST trong tế bào tinh trùng.

Mục tiêu: hoàn thiện quy trình kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong phân tích lệch bội nhiễm sắc thể từ tế bào tinh trùng.

Đối tượng và phương pháp: 15 mẫu tinh dịch được thực hiện lai huỳnh quang tại chỗ để phân tích tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng tại Trung tâm Di truyền lâm sàng- Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và Trung tâm Xét nghiệm quốc tế Gentis - Công ty cổ phần dịch vụ phân tích di truyền Gentis.

Kết quả: 15/15 mẫu tinh trùng thực hiện thành công kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ để phân tích lệch bội cho 5 NST (13, 18, 21, X, Y).

Kết luận: Kỹ thuật FISH thực hiện qua nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn đều có những đặc điểm riêng phù hợp với đặc điểm cấu tạo, tính chất màng tế bào và DNA tinh trùng, để đảm bảo quy trình thành công và kết quả phân tích rõ ràng, cho phép phát hiện chính xác tỉ lệ lệch bội NST từ tế bào tinh trùng.

Từ khoá: lai huỳnh quang tại chỗ, nhiễm sắc thể tinh trùng, lệch bội nhiễm sắc thể

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Phân tích tinh dịch ở nam giới là phương pháp cơ bản và trực quan nhất để đánh giá khả năng sinh sản của một người nam giới. Các chỉ số phân tích tinh dịch cơ bản bao gồm: mật độ tinh trùng, tổng số lượng tinh trùng, hình thái, khả năng di động của tinh trùng… nhưng thường không đánh giá được vật chất di truyền của các tế bào tinh trùng. Vật chất di truyền của tế bào tinh trùng có thể ảnh hưởng trực tiếp tới sự thụ tinh tạo phôi, cũng như kết quả của thai kỳ, từ đó gây hậu quả là người nam mắc vô sinh hiếm muộn, gây sảy thai, thai lưu, hoặc có thể là sinh ra con mắc các dị tật di truyền như lệch bội nhiễm sắc thể (NST). Lệch bội NST tinh trùng là một chỉ số cho phép đánh giá trực tiếp vật chất di truyền của tế bào tinh trùng.

Lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hybridization - FISH) là một phương pháp phổ biến nhất và hiệu quả nhất để đánh giá tình trạng lệch bội NST tinh trùng người 1, 2. Nguyên lý của kỹ thuật FISH là sử dụng mẫu DNA dò lai với trình tự ADN của mẫu bệnh phẩm bằng trình tự bổ sung, nhờ đó phát hiện, định vị được chuỗi ADN đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang,’ xác định các bất thường NST cụ thể về số lượng hoặc cấu trúc. Kỹ thuật FISH thực hiện trên các tế bào nguyên vẹn màng tế bào, cho phép đánh giá vật chất di truyền ở từng tế bào riêng lẻ.

Trên thế giới, kỹ thuật FISH để phát hiện lệch bội NST tinh trùng đã được thực hiện từ lâu. Nhiều nghiên cứu cho thấy tỉ lệ lệch NST bội tinh trùng cao có liên quan đến các tình trạng vô sinh hiếm muộn, sảy thai nhiều lần do nam giới 3, 4, 5, 6, 7, thậm chí ảnh hưởng tới kết quả của các biện pháp hỗ trợ sinh sản, đặc biệt là phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI)8, 9, 10. Ngoài ra, tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng còn được cho là có mối liên hệ đang kể với các chỉ số phân tích tinh dịch khác như: mật độ tinh trùng, mức độ phân mảnh DNA tinh trùng 5, 11, 12, 13

Ở Việt Nam, việc kỹ thuật FISH để phân tích tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng là còn rất mới. Kỹ thuật này đòi hỏi quy trình thực hiện phức tạp và nghiêm ngặt, nhân lực được đào tạo chuyên sâu về việc phân tích cũng như tư vấn kết quả. Thực hiện kỹ thuật này thành công cho phép bác sĩ có thêm chỉ số để đánh giá khả năng sinh sản của nam giới, cũng như việc áp dụng trong các nghiên cứu về vấn đề vô sinh hiếm muộn, bất thường sinh sản ở nam giới.

Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là:Hoàn thiện kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ để phân tích tỉ lệ lệch bội NST tinh trùng

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.   Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu đáp ứng các yêu cầu: 

+ Lấy mẫu tinh dịch theo đúng hướng dẫn của WHO cho phân tích tinh dịch

+ Mẫu tinh dịch được phân tích cơ bản

- Thời gian nghiên cứu: từ 04/2022 đến 07/2022

- Địa điểm: Trung tâm Di truyền lâm sàng và hệ gen, bệnh viện Đại học Y hà Nội; trung tâm xét nghiệm quốc tế Gentis, công ty cổ phần dịch vụ phân tích di truyền Gentis.

2.2.   Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp mô tả cắt ngang

2.2.1. Lấy mẫu tinh dịch: theo huớng dẫn của WHO (2021) cho mẫu để phân tích tinh dịch

2.2.2. Cố dịnh tế bào: nhược trương tế bào, sử dụng dung dịch Carnoy (3 Methanol: 1 Acid axetic) để rửa sạch và cố định tế bào tinh trùng trên các lam kính

2.2.3. Bộc lộ DNA tinh trùng: sử dụng Ethanol để khử nước và dung dịch dithiothreitol (DTT) để bộc lộ DNA của tinh trùng

2.2.4. Lai tín hiệu: sử dụng bộ kit Cytocell prenatal enumeration FISH probe cho các NST: 13, 18, 21, X, Y.

2.2.5. Phân tích kết quả: dựa trên các tiêu chuẩn nghiêm ngặt có sẵn

2.2.6. Xử lí số liệu

2.3.   Đạo đức nghiên cứu

Các số liệu và thông tin nghiên cứu là chính xác, trung thực, khách quan và được chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Bệnh nhân hoặc người giám hộ hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật và chỉ phục vụ công tác nghiên cứu

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Cố định tế bào

Trước khi cố định tế bào tinh trùng bằng dung dịch Carnoy, các tế bào tinh trùng được cho vào trong môi trường nhược trương (dung dịch KCl) nhằm làm giản nở không gian giữa các NST, làm các sợi DNA dễ được bộc lộ hơn ở bước sau. Sau đó tế bào tinh trùng được trải đều và cố định trên các lam kính.

Hình 3.1. Hình ảnh tín hiệu lai trong tế bào tinh trùng với các mức độ nhược trương khác nhau

Nhận xét: Khi tế bào được nhược trương chưa đủ, các sợi DNA khó để được bộc lộ ra, dẫn đến quá trình lai không thể thực hiện được.

Thao tác cố định tinh trùng trên lam kính cần đảm bảo các tế bào tinh trùng không dính vào nhau, nhưng cũng không được có mật độ quá ít, dẫn đến quá trình đọc kết quả tốn nhiều thời gian. Sau khi cố định tế bào, cần kiểm tra lại mật độ tế bào tinh trùng dưới kính hiển vi.

3.2 Bộc lộ DNA tinh trùng

Các tế bào tinh trùng được khử nước từ từ bằng các dung dịch Ethanol có nồng độ tăng dần, với mục đích hạn chế sự tổn thương vật chất di truyền của tế bào khi khử nước quá nhanh. Sau đó sử dụng dung dịch DTT để cắt đứt các cầu nối disulfua của protamine trong cấu trúc sợi nhiễm sắc của tinh trùng, giúp bộc lộ DNA tinh trùng, cho phép quá trình lai diễn ra. Khi không sử dụng dung dịch DTT, sau khi thực hiện kỹ thuật, không có các tín hiệu lai trong tế bào tinh trùng.

Bảng 3.1. Thời gian, nồng độ DTT tối ưu cho lai tín hiệu ở tế bào tinh trùng

Nhận xét: Thời gian và nồng độ tối ưu của dung dịch DTT sử dụng khác nhau ở mỗi loại probe cho các NST khác nhau, để cho tín hiệu lai tốt nhất

• Lai tín hiệu

Bắt đầu quá trình lai bằng việc biến tính sợi DNA bằng dung dịch Formamide, sau đó phủ kín vùng chứa probe bằng bằng lamen. Ủ slide trong buồng tối ở 37⁰C.

Hình 3.2. Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang ở tế bào tinh trùng sau các thời gian lai khác nhau

Nhận xét: Thời gian lai khác nhau cho các kết quả lai khác nhau: lai trong thời gian ngắn (2h), các tín hiệu lai chỉ xuất hiện ở các tế bào bạch cầu, mà không có trong các tế bào tinh trùng. Khi thực hiện lai trong thời gian trung bình (12h), tín hiệu lai không rõ nét xuất hiện trong một số tế bào tinh tùng; khi thực hiện lai trong thời gian dài (24h), tín hiệu lai rõ nét xuất hiện ở hầu hết các tế bào tinh trùng.

• Phân tích kết quả

Kết quả lai được đọc trên kính hiển vi huỳnh quang với các filter lọc có thông số phù hợp với bước sóng phát ra từ các probe tương ứng. Việc đánh giá các tín hiệu lai trong tế bào cần đảm bảo các yêu cầu nghiêm ngặt ^{1, 14, 15, 16}: chỉ đánh giá các tế bào tinh trùng có đường viền nguyên vẹn và nhân giới hạn rõ ràng; các tín hiệu lai phải rõ ràng (trong một tế bào, khi có 2 tín hiệu lai cùng màu, thì các tín hiệu phải cách nhau ít nhất một khoảng cách tương đương với 1 tín hiệu thăm dò). Các tế bào được coi là bất thường khi có nhiều hơn 1 tín hiệu cho cùng một NST được phát hiện. Khi không phát hiện được tín hiệu của một NST, cần xem xét đó là kết quả của sự lai thất bại hay do bất thường NST.

Hình 3.3. Hình ảnh các tín hiệu lai bình thường và bất thường ở tế bào tinh trùng

Nhận xét: Các tế bào được phân tích dựa trên các tiêu chuẩn nghiêm ngặt có sẵn ^{1, 14, 15, 16}

Vì số lượng các tế bào tinh trùng của mỗi người thường là rất nhiều, nhưng tỉ lệ dị bội lại rất thấp, do vậy cần phân tích số lượng lớn các tế bào tinh trùng để có thể phát hiện ra các tế bào dị bội. Tuy nhiên, việc đánh giá số lượng quá lớn cho mỗi bệnh nhân trong thực hành lâm sàng là không khả thi, bởi tiêu tốn quá nhiều thời gian cũng như nhân công thực hiện. Theo nhiều nghiên cứu, để kết quả đánh giá được toàn diện và khách quan nhất, số lượng tế bào cần phân tích cho mỗi bệnh nhân là ít nhất 1000 tế bào ^{17, 18}.

Bảng 3.3. Mật độ, số lượng tinh trùng và số tế bào tinh trùng được phân tích số lượng NST

Nhận xét: Tất cả các mẫu tinh trùng đều được thực hiện thành công kỹ thuật FISH, nhưng các mẫu có tổng số tinh trùng từ dưới 6 triệu tinh trùng/ mẫu không đủ tế bào để thực hiện phân tích kết quả.

IV. BÀN LUẬN

FISH là một kỹ thuật khó với quy trình nhiều bước, thao tác phức tạp. Quy trình FISH sử dụng mẫu tinh dịch có nhiều điểm khác biệt so với mẫu các tế bào soma (mẫu máu ngoại vi, mẫu tế bào ối), vì vậy quá trình thao tác quy trình đòi hỏi sự chính xác và kinh nghiệm từ người thực hiện được đào tạo chuyên sâu.

Bảng 4.1. So sánh sự khác biệt của quy trình FISH  trên tinh trùng và tế bào soma

Trong các tế bào soma và tế bào trứng, các sợi nhiễm sắc được cấu tạo bởi các nucleosome dựa trên các protein histone, nhưng trong tế bào tinh trùng, 85% protein histon được thay thế bằng protamine ^{19, 20}. Protamine có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tính toàn vẹn DNA của tinh trùng khỏi các gốc tự do , và giúp ngưng tụ chất nhiễm sắc của tinh trùng, nén các sợi nhiễm sắc của tinh trùng hơn gấp 10 lần so với ở các tế bào soma ²⁰. Chính sự nén chặt của chất nhiễm sắc trong tế bào tinh trùng là nguyên nhân dẫn đến sự khó bộc lộ sợi DNA khi thực hiện kỹ thuật FISH. Quá trình nhược trương tế bào cần đủ để tế bào tinh trùng được mở rộng không gian chứa đựng các sợi nhiễm sắc, làm các hoá chất sử dụng dễ tiếp cận với sợi nhiễm sắc. Giữa các phân tử protamine có các liên kết disulfide -  đóng vai trò giúp ổn định sự ngưng tụ chất nhiễm sắc, bất hoạt tạm thời các sợi DNA, làm các sợi nhiễm sắc trơ với hoạt động của các enzyme ²¹. DTT là hoá chất có khả năng cắt đứt các cầu nối disulfide này, giúp giải phóng sợi DNA khỏi sự gắn kết với protamine để có thể tiến hành quá trình lai

Với quy trình kỹ thuật được chúng tôi xây dựng, tỉ lệ thực hiện thành công là 100% (15/15 mẫu). Tuy nhiên có 2 mẫu với tổng số lượng tinh trùng dưới 5 triệu tinh trùng/ mẫu, tuy vẫn lai thành công tín hiệu huỳnh quang, nhưng không đáp ứng đủ số lượng tế bào bị phân tích. Các thao tác thực hiện quy trình: ly tâm loại bỏ dịch nổi, cố định tế bào tinh trùng lên lam kính, hay diện tích lai hoá là yếu tố làm mất một số lượng tinh trùng, và một số không được lai hoá. Những nguyên nhân này khiến số lượng tế bào thực tế được lai hoá là rất ít so với tổng số tế bào tinh trùng ban đầu có trong mẫu. Để khắc phục vấn đề này, các thao tác cần được thực hiện chính xác để tiết kiệm tối đa số tinh trùng thu được để phân tích.

Sự phân tích kết quả thu được cần dựa vào các tiêu chuẩn nghiêm ngặt đã được đưa ra từ nhiều tác giả ^{1, 14, 15, 16} cũng như từ nhà sản xuất. Các tiêu chí nghiêm ngặt này đảm bảo sự khách quan để đánh giá kết quả. Phân tích số lượng lớn các tế bào cho mỗi mẫu là cần thiết để đảm bảo kết quả được chính xác và toàn diện nhất. Tuy nhiên phân tích số lượng quá lớn cho mỗi mẫu là không khả thi. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy phân tích 1000 tinh trùng là cần thiết để cung cấp thông tin đáng tin cậy.

V. KẾT LUẬN

Trong số 15 mẫu tinh dịch thực hiện quy trình FISH, 100% các mẫu đều được thực hiện thành công kỹ thuật. Vì sự khác nhau giữa cấu trúc các loại tế bào, kỹ thuật FISH thực hiện trên tế bào tinh trùng không thể dùng các quy trình thông thường cho tế bào lympho máu ngoại vi. Quy trình đòi hỏi người thực hiện phải được đào tạo chuyên sâu và có nhiều kinh nghiệm về kỹ thuật thực hiện cũng như phân tích kết quả.

Quy trình kỹ thuật của chúng tôi vẫn còn một số nhược điểm về yêu cầu số lượng tinh trùng trong mẫu ban đầu. Do vậy, việc cải tiến kỹ thuật là luôn cần thiết để nâng cao hiệu quả và đơn giản hoá quy trình.

CLICK Tại đây để xem bài được đăng tải trên Tạp chí Y học Việt Nam

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kathleen Hwang, John W. Weedin, Dolores J. Lamb. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Ther Adv Urol. 2010;2(4):157-169.
2. C.M. Luetjens, C. Rolf, P. Gassner et al. Sperm aneuploidy rates in younger and older men. Human Reproduction. 2002;17(7):1826-1832.
3. S. Al-Hassan, A. Hellani, A. Al-Shahrani et al. Sperm Chromosomal Abnormalities In Patients With Unexplained Recurrent Abortions. Archives of Andrology. 2005/01/01 2005;51(1):69-76.
4. Bernardini LM, Costa M, Bottazzi C et al. Sperm aneuploidy and recurrent pregnancy loss. Reprod Biomed Online. 2004;9(3):312-320.
5. Ines Zidi-Jrah, Amani Hajlaoui, Soumaya Mougou-Zerelli et al. Relationship between sperm aneuploidy, sperm DNA integrity, chromatin packaging, traditional semen parameters, and recurrent pregnancy loss. Fertility and Sterility. 2016;105(1):58-64.
6. Yifu Pu, Xiaoli Yang, Yujin Guo et al. Sperm aneuploidy and recurrent pregnancy loss: A systematic review and meta-analysis. CELL, MOLECULAR & DEVELOPMENTAL BIOLOGY. 2020;6(1)
7. Marjan Pourfahraji Fakhrabadi, Seyed Mahdi Kalantar, Fatemeh Montazeri et al. FISH-based sperm aneuploidy screening in male partner of women with a history of recurrent pregnancy loss. Middle East Fertility Society Journal. 2020/07/01 2020;25(1):23.
8. Munné S, Alikani M, Tomkin G et al. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities. Fertil Steril. 1995;64(2):382-391.
9. D Ioannou, J Fortun, H G Tempest. Meiotic nondisjunction and sperm aneuploidy in humans. Reproduction. 2019;157(1)
10. Lorena Rodrigo, Marcos Meseguer, Emilia Mateu et al. Sperm chromosomal abnormalities and their contribution to human embryo aneuploidy. Biology of Reproduction. 2019;101(6):1091-1101.
11. R. Ramasamy, J. M. Scovell, J. R. Kovac et al. Fluorescence in situ hybridization detects increased sperm aneuploidy in men with recurrent pregnancy loss. Fertil Steril. Apr 2015;103(4):906-909.e1.
12. Zaida Sarrate, Francesca Vidal, Joan Blanco. Role of sperm fluorescent in situ hybridization studies in infertile patients: indications, study approach, and clinical relevance. Fertility and Sterility. 2010;93(6):1892-1902.
13. M. Arumugam, D. P. Shetty, J. S. Kadandale et al. Association of Sperm Aneuploidy Frequency and DNA Fragmentation Index in Infertile Men. J Reprod Infertil. Jul-Sep 2019;20(3):121-126.
14. Francesca Branch, GiaLinh Nguyen, Nicholas Porter et al. Semi-automated scoring of triple-probe FISH in human sperm using confocal microscopy. Cytometry Part A. 2017;91(9):859-866.
15. Elena García-Mengual, Juan Carlos Triviño, Alba Sáez-Cuevas et al. Male infertility: establishing sperm aneuploidy thresholds in the laboratory. J Assist Reprod Genet. 2019;36(3):371-381.
16. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sixth ed. 2021.
17. Maria Oliver Bonet. FISH on Sperms, Spermatocytes and Oocytes. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) - Application Guide. Springer Science & Business Media; 2008:170:chap 16.
18. H. G. Tempest, D. J. Gillott, M. Grigorova et al. Sperm aneuploidy: when to stop counting? Fertility and Sterility. 2009;92(3):S141-S142.
19. L. Moritz, S. S. Hammoud. The Art of Packaging the Sperm Genome: Molecular and Structural Basis of the Histone-To-Protamine Exchange. Frontiers in endocrinology. 2022;13:895502.
20. Muslim Akmal, Aulanni'am Aulanni'am, M. Aris Widodo et al. The important role of protamine in spermatogenesis and quality of sperm: A mini review. Asian Pacific Journal of Reproduction. 2016/09/01/ 2016;5(5):357-360.
21. Alexander V. Emelyanov, Dmitry V. Fyodorov. Thioredoxin-dependent disulfide bond reduction is required for protamine eviction from sperm chromatin. Genes & Dev. 2016;30:2651-2656.