Báo cáo: Chẩn đoán Thalasemia phôi tiền làm tổ (PGD-Thalassemia)

Thalassemia - Bệnh tan máu bẩm sinh hay thiếu máu huyết tán bẩm sinh là một bệnh rối loạn máu di truyền gây thiếu máu và ứ đọng sắt trong cơ thể. Có 2 dạng bệnh Thalassemia là α-Thalassemia và β-Thalassemia. Các đột biến Thalassemia di truyền theo định luật Mendel. Nếu cả bố và mẹ đều mang gen đột biến (có thể chưa biểu hiện thành bệnh) thì khả năng con sinh ra bị bệnh ở thể nặng là 25%. Ở Việt Nam, có khoảng 7-10% dân số mang gen bệnh, 20.000 người bị Thalassemia thể nặng và mỗi năm có khoảng trên 2.000 trẻ sinh ra bị mắc Thalassemia.

Việc sàng lọc trước sinh cho thai nhi có thể được thực hiện bằng phương pháp sinh thiết gai nhau ở thai kỳ 11-14 tuần, phương pháp chọc ối ở thai kỳ trên 15 tuần hoặc phân tích máu dây rốn cho thai kỳ trên 18 tuần. Nếu thai nhi bị phát hiện có mang các đột biến có thể bị đình chỉ thai thì sẽ ảnh hưởng đến người mẹ không chỉ về mặt sức khỏe mà còn về mặt tinh thần.

Hiện nay, chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (PGD) có thể chẩn đoán sớm các phôi bào được thụ tinh ống nghiệm (IVF) để lựa chọn những phôi bào không mang các gen đột biến α- và β-Thalasseia di truyền từ bố mẹ là nhu cầu chính đáng của các gia đình có mang gen đột biến. Điều này vừa giúp chẩn đoán sớm vừa tránh được những tổn thương cho người mẹ và gia đình. Đồng thời các phôi bào cũng được sàng lọc các bất thường lệch bội 24 nhiễm sắc thể (PGS) để làm giảm khả năng chuyển phôi thất bại, sảy thai ngẫu nhiên do bất thường nhiễm sắc thể từ đó làm tăng tỷ lệ thành công của quy trình chẩn đoán, giảm số chu kỳ IVF mà một cặp vợ chồng phải thực hiện cũng như tránh lãng phí phôi được lựa chọn.

Sau khi được thực hiện IVF, phôi được sinh thiết vào ngày thứ 3 hoặc ngày thứ 5. DNA các tế bào sinh thiết được tách chiết, nhân lên tự do, ngẫu nhiên toàn bộ hệ gen (Whole Genome Amplification) sau đó thực hiện sàng lọc các bất thường lệch bội 24 nhiễm sắc thể (PGS). Các phôi không mang các bất thường NST sẽ được tiếp tục thực hiện xét nghiệm nhằm phát hiện sự có mặt của các đột biến gây bệnh.

Đối với xét nghiệm PGD-α-Thalassemia, GENTIS tập trung xây dựng quy trình xét nghiệm chẩn đoán phôi đối với các cặp vợ chồng mà cả 2 người đều mang đột biến α^SEA. GENTIS sử dụng GAP-PCR và một số STR đặc hiệu để xây dựng bộ kit xét nghiệm với hai phương pháp xét nghiệm độc lập, trong đó phương pháp thứ nhất sử dụng GAP-PCR với bộ ba mồi NaI, NaII và NaIII, cặp mồi W chẩn đoán nằm giữa vị trí mất đoạn của đột biến α^SEA nhằm xác nhận sự có mặt của vùng DNA của họ gen α-globulin và cặp mồi STR D16S539 như nội chuẩn của phản ứng PCR. Phương pháp thứ hai xây dựng trên 3 STR: 16TEL05, 16TEL06 nằm trên vùng đột biến mất đoạn và D16S475 như nội chuẩn của phản ứng PCR đồng thời để đánh giá Allele Drop Out, tương ứng với 3 cặp mồi khuếch đại 3 vùng STR trên. Kết quả từ 2 phương pháp trên được đối chiếu so sánh, để đưa ra kết luận chính xác về kiểu gen.

Đối với xét nghiệm PGD-β-Thalassemia, GENTIS sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng trên vùng gen HBB nhằm phát hiện sự có mặt các đột biến của bố mẹ trên phôi. Nhằm loại bỏ Allenle Drop Out có thể xảy ra gây ra sai sót trong quá trình xét nghiệm, GENTIS đồng thời sử dụng bộ mồi khuếch đại 3 STR gồm D11S1760, D11S1338, D11S1871 sử dụng cho phân tích di truyền, từ đó đảm bảo kết luận được chính xác.

GENTIS đã thực hiện xét nghiệm PGD-α-Thalassemia cho 2 cặp vợ chồng mang đột biến dị hợp α^SEA. Đối với cặp vợ chồng thứ nhất, 12 phôi được sinh thiết, thực hiện khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA) và thực hiện xét nghiệm PGS, kết quả có 2 phôi mang bất thường lệch bội nhiễm sắc thể sẽ không được thực hiện các xét nghiệm về sau. 10 phôi không mang bất thường số lượng NST còn lại tiếp tục được phân tích đột biến α^SEA và thu được kết quả như sau: 7 phôi mang đột biến α^SEA dị hợp và 3 phôi không mang đột biến.

Đối với cặp vợ chồng thứ 2, sinh thiết từ 6 phôi bào cũng được trải qua xét nghiệm tương tự, thu được kết quả như sau: 1 phôi mang bất thường số lượng NST, trong 5 phôi không bất thường số lượng NST còn lại có 4 phôi mang đột biến α^SEA dị hợp tử và 1 phôi mang đột biến α^SEA đồng hợp tử.

Bên cạnh đó, GENTIS cũng thực hiện xét nghiệm PGD-β-Thalassemia đối với một cặp vợ chồng mang đột biến dạng dị hợp tử β-Thalassemia, trong đó người chồng mang đột biến 1557G->T và người vợ mang đột biến CD41/42. Từ 11 sinh thiết phôi của 2 chu kỳ IVF, kết quả PGS cho thấy có 2 phôi mang bất thường NST. Trong 9 phôi còn lại, có 3 phôi mang đột biến dị hợp tử CD41/42, 2 phôi mang đột biến dị hợp tử 1557G->T, 2 phôi mang cả 2 đột biến CD41/42 và 1557G->T dạng dị hợp tử kép và 3 phôi không mang đột biến.

GENTIS đã xây dựng thành công quy trình chẩn đoán phôi tiền làm tổ cho bệnh Thalassemia vốn là nhu cầu cấp thiết và chính đáng đối với các cặp vợ chồng mang gen đột biến Thalassemia thể ẩn. Để hoàn thiện quy trình, trong thời gian sắp tới chúng tôi tiếp tục tăng số lượng phôi chẩn đoán và theo dõi các trẻ ra đời sau thực hiện xét nghiệm PGD. Đây cũng là tiền đề cho việc phát triển các bộ kit PGD cho bệnh lý đơn gen khác.